水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫前處理試劑盒型號:QCL2
水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫的快速測定方法
液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)(SN/T1768-2006)
1 原理
試樣中殘留的孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物用孔雀石綠、結(jié)晶紫快速檢測前處理試劑盒提供的試劑提取、用孔雀石綠柱濃縮凈化后用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測,外標(biāo)法定量。
2 試劑和材料
除另有規(guī)定外,所有試劑均為分析純,水為重蒸餾水。
2.1乙腈:色譜純。
2.2無水乙酸銨。
2.3冰乙酸:色譜純。
2.4 乙腈酸溶液:乙腈+冰乙酸(98+2,V/V)。
2.5 甲醇酸溶液:甲醇+冰乙酸(80+20,V/V)。
2.6 乙腈水溶液:乙腈+水(20+80,V/V)。
2.7 5mmol/L乙酸銨緩沖溶液:稱取0.385 g無水乙酸銨,溶解于大約980 mL水中,用冰乙酸調(diào)節(jié)pH到4.5,zui后用水定容到1000 mL,過0.20 μm濾膜。
2.8標(biāo)準(zhǔn)品: 孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫純度大于98 %。
2.9標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液:準(zhǔn)確稱取孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫各10mg,用乙腈分別溶解定容于100 mL容量瓶中,配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。
2.10 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:用流動相稀釋標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液,配制成孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫均為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。0℃~4℃避光保存。
2.11孔雀石綠、結(jié)晶紫快速檢測前處理試劑盒* 。
3 儀器和設(shè)備
3.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀:配有電噴霧(ESI)離子源。
3.2勻漿機(jī)。
3.3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。
3.4離心機(jī):4000 r/min。
3.5振蕩器。
3.6聲波水浴。
3.7聚四氟乙烯離心管:2.5 mL,50 mL,帶塞。
3.8微孔濾膜:0.45 μm。
4 測定步驟
4.1提取和凈化
提取:準(zhǔn)確稱取已搗碎的樣品5.00 g于50 mL離心管中,先加入孔雀石綠、結(jié)晶紫快速檢測前處理試劑盒中的提取劑1*(液體20.0 mL),用勻漿機(jī)以8 000 r/min的速度均質(zhì)30 s,再加入提取劑2*(固體粉末), 振蕩1 min,4 000 r/min離心5 min。
凈化:層析柱依次用2mL乙腈酸溶液(2.4)、5mL甲醇酸溶液(2.5)、5mL蒸餾水激活,再取上清液5mL于50mL試管中,加入10~15mL水混勻, 分次加入孔雀石綠層析柱中,用吸耳球從上口擠壓加快流速或用固相萃取機(jī)從下抽真空,液體流完后加5mL乙腈水溶液(2.6)洗滌,擠干柱中液體,用 0.8mL乙腈酸溶液(2.4)洗脫,收集洗脫液,用緩沖液(2.7)定容至1mL。微孔濾膜過濾,濾液供儀器測定。
4.2繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線
移取孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫混和標(biāo)準(zhǔn)溶液,用流動相稀釋成0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定,得出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
4.3測定
4.3.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件
a) 色譜柱:C18柱,150 mm×2.1 mm(i.d.),粒度5 μm;
b) 流動相:乙腈+5 mmol/L乙酸銨(75+25,V/V);
c) 流速:0.2 mL/min;
d) 柱溫:35℃;
e) 進(jìn)樣量:10 μL;
f) 離子源:電噴霧ESI,正離子;
g) 掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測MRM;
h) 霧化氣、窗簾氣、輔助加熱氣、碰撞氣均為高純氮?dú)?;使用前?yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到要求;
i) 噴霧電壓、去集簇電壓、碰撞能等電壓值應(yīng)優(yōu)化至*靈敏度;
j) 監(jiān)測離子對:孔雀石綠m/z 329/313(定量離子)、329/208;隱色孔雀石綠m/z 331/316(定量離子)、331/239;結(jié)晶紫m/z 372/356(定量離子)、372/251;隱色結(jié)晶紫m/z 374/358(定量離子)、374/238。
4.4液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量測定
按照2.4.2.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件測定樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定樣液中的孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫含量。樣品中被測物殘留量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi),如果含量出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍,應(yīng)用流動相適當(dāng)稀釋。在上述色譜條件下, 孔雀石綠 、結(jié)晶紫 、隱色孔雀石綠 、隱色結(jié)晶紫的保留時(shí)間約為1.89 min、5.35 min、2.47 min和5.51 min。標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜-電噴霧質(zhì)量色譜圖見附錄B中的圖B.1。
4.5液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定性測定
按照2.4.2.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件測定樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,分別計(jì)算樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中兩對離子對色譜峰面積的比值,僅當(dāng)兩者數(shù)值的相對偏差小于25%時(shí)方可確定兩者為同一物質(zhì)。
4.6空白試驗(yàn)
除不加試樣外,均按上述測定步驟進(jìn)行。
5結(jié)果計(jì)算表述
按式(1)分別計(jì)算供試樣品中的孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫和隱色結(jié)晶紫殘留量,計(jì)算結(jié)果需扣除空白。
4×ci×V
ω = …… (1)
m
ω-水產(chǎn)品中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫或隱色結(jié)晶紫殘留量,μg/kg;
ci -標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出試樣溶液中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫和隱色結(jié)晶紫的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度,μg/L;
V-zui終定容體積數(shù),mL;
4-換算常數(shù);
m-供試試料樣品重量,g。
本方法分別計(jì)算孔雀石綠及代謝物隱色孔雀石綠,并分別報(bào)告孔雀石綠及代謝物隱色孔雀石綠結(jié)果。
本方法分別計(jì)算結(jié)晶紫及代謝物隱色結(jié)晶紫,并分別報(bào)告結(jié)晶紫及代謝物隱色結(jié)晶紫結(jié)果。
6測定低限、回收率
6.1測定低限
本方法孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫的檢測低限均為0.5 μg/kg。
6.2回收率
本方法孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫回收率均為:85%~105%;